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HT-29細(xì)胞 HT-29細(xì)胞

發(fā)布時(shí)間:2016-06-02瀏覽:1693次

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根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn),傳代方法有3種:懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代、半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代(Hela細(xì)胞)、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代。

培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代;部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打可傳代;懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打傳代。

1.  貼壁細(xì)胞的消化法傳代:

(1)吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。

(2)D-Hanks液洗2~3次。

 (3)向瓶?jī)?nèi)加入適量消化液(胰蛋白酶或與EDTA混合液)輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細(xì)胞表面。

(4)然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液,輕輕搖動(dòng)再倒掉大部分消化液,僅留少許進(jìn)行消化(也可不采用上述步驟直接加消化液進(jìn)行消化)。

(5)消化在37℃或室溫25℃以上環(huán)境下進(jìn)行。

(6)消化2~5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大后,應(yīng)立即終止消化。

(7)吸除或倒掉消化液,如用EDTA消化,需加Hanks液數(shù)毫升,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉。

(8)再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液,終止消化。

(9)用彎頭吸管,吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液,反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,吹打過(guò)程要順序進(jìn)行。

(10)從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束,以確保所有底部都被吹到,使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛。

(11) 計(jì)數(shù),分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

2.  懸浮細(xì)胞的傳代:懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代,或直接傳代。

離心傳代法:

(1) 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

(2) 離心800~1000 rpm,5 min。

(3) 棄去上清,加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi),用吸管吹打形成細(xì)胞懸液。

(4) 計(jì)數(shù),分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

(5)直接傳代即讓?xiě)腋〖?xì)胞慢慢沉淀在瓶底后,將上清液吸掉1/2~2/3,然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細(xì)胞的傳代

(1)部分貼壁不牢的細(xì)胞,如Hela細(xì)胞等,不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來(lái),而進(jìn)行傳代。

(2)對(duì)絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大,細(xì)胞常有較大數(shù)量的丟失,因而需消化后,才能吹打傳代。

注意事項(xiàng):

1.  胰蛋白酶要預(yù)溫,溫度37℃左右為宜℃。

2.  離心轉(zhuǎn)速要合適,轉(zhuǎn)速過(guò)低,不能有效分離細(xì)胞,離心速度過(guò)大,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。

3.  要定時(shí)觀察細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)污染,應(yīng)及時(shí)處理。

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