ELISA不同方法介紹

我們知道ELISA方法也包含不同的方法和原理，主要有：雙抗夾心法ELISA、雙位點一步法ELISA、間接法ELISA、雙抗原夾心法ELISA、競爭抑制法ELISA、IgM抗體捕獲法ELISA、應(yīng)用親和素和生物素ELISA；下面我們就這幾種不同ELISA方法，逐一介紹：

一、雙抗夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，但僅適用于2價或2價以上抗原的檢測，而不適用于小分子抗原或半抗原物質(zhì)的測定。其測定原理是將特異性抗體包被于固相載體上，形成固相抗體；加入含待測抗原的樣品，使之與固相抗體結(jié)合；再加入酶標(biāo)記的另一特異性抗體，使酶標(biāo)抗體與固相免疫復(fù)合物中的抗原結(jié)合；zui后加入底物顯色。溶液顏色的深淺與標(biāo)本中待測抗原的量成正比。

二、雙位點一步法

    雙位點一步法是在雙抗體夾心法的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的，應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同表位的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，在測定時可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時加入。這種方法的優(yōu)點是簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，而且由于使用了高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高；缺點是當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高，大大超過了固相抗體的結(jié)合能力時，可能出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)（hook effect），即過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，測得結(jié)果將低于實際含量，嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性。

三、 間接法  

    間接法主要用于檢測抗體，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相抗原結(jié)合的待測抗體。首先用特異性抗原包被固相載體，加入含待測抗體的樣品，使之與固相抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的第2抗體，使之與待測抗體結(jié)合；反應(yīng)后再加入底物顯色，顏色的深淺與標(biāo)本中待測抗體的量成正比。此方法的特點是只需一種酶標(biāo)記的第2抗體就可以檢測多種抗體，因而在臨床中廣泛用于檢測各種感染性疾病的抗體；缺點是易受到標(biāo)本中多種物質(zhì)的干擾而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

四、 雙抗原夾心法  

    雙抗原夾心法與間接法的不同是用酶標(biāo)記的特異性抗原代替酶標(biāo)記的第2抗體，可以減少假陽性反應(yīng)。

五、競爭抑制法

    該法可用于檢測抗原或抗體，顯色的深淺與標(biāo)本中待測抗原或抗體量成反比。以測定抗原為例，待測樣品中的抗原與酶標(biāo)記抗原競爭與固相抗體結(jié)合，待測抗原含量越多，能與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原就越少，則顯色越淺。

六、IgM抗體捕獲法

    血清中針對某些抗原的特異性IgM常和非特異性IgM，以及特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM的測定。捕獲法則較好地解決了上述問題，其原理是先用抗人IgM（／／鏈）抗體包被固相載體，使血清中所有IgM（包括特異性與非特異性IgM）均固定在固相上，經(jīng)洗滌去除IgG后，再測定特異性IgM。此方法目前主要用于檢測各類早期感染的特異性抗體IgM。

七、應(yīng)用親和素和生物素方法

    親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取，分子量為60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子緊密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244．31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素-羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide ester，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結(jié)合位點，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELISA耦聯(lián)起來，就可大大提高其靈敏度。

    親和素生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過親和素生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且可使其結(jié)合點充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)記抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素與酶的結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號。